안녕하세요 한헌종입니다.
오늘은 bam / sam 파일에 있는 flag 에 대해, 그리고 이 flag 정보를 요약해 보여주는 samtools flagstat 결과에 대해 알아보겠습니다.

BAM / SAM 파일의 flag 란?

flag 란 무엇일까요?
flag 는 bam / sam 파일에서 각 read alignment 에 대한 설명을 숫자로 나타낸 것이에요.
이 flag 는 0 ~ 4095 사이의 숫자인데요, SAM 파일의 두 번째 컬럼이 가지고 있는 숫자를 말해요.
이전 포스트에 있는 그림을 다시 보여드릴게요.

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SAM 파일의 예시. 2 번째 컬럼 (B) 에 적힌 숫자가 각 read 에 대한 flag 입니다.

read1 의 flag 는 16, read2 의 flag 는 1032 이군요.
그럼 이 숫자가 무엇을 뜻하는 걸까요?
이걸 알아내려면 flag 를 이진수로 나타내봐야 합니다.

flag 를 이진수로 나타내기

flag 는 0~4095 사이의 숫자라고 했죠?
이를 2진수로 바꾸면 최대 12자리 이진수가 됩니다. (이때 빈 자릿수는 0으로 채워서 12자리를 맞춰줍니다.)
예를 들어 16 이라는 flag 값을 2진수로 나타내면 000000010000 가 되구요,
1032 라는 flag 값을 2진수로 나타내면 010000001100 가 됩니다.

왜 flag 값을 12자리의 2진수로 바꾸는 걸까요?

이는 read alignment 가 가질 수 있는 12가지 특성 각각이 있느냐, 없느냐를 표현하기 위해서에요.
2진수로 바꾼 flag 값에서 각 자리수는 각 특성을 나타내고, 1 이 의미하는 것은 해당 특성을 가지고 있다는 뜻이에요.
예를 들어 1032 라는 flag 값을 이진수로 나타낸 010000001100 를 보시죠.
이 숫자를 보면, 뒤에서 3번째 / 4번째 / 11번째 숫자가 1이고, 나머지는 모두 0이네요. (뒤에서부터 세어야 합니다)
즉, 이 read alignment 는 12가지 특성 중 3번째 / 4번째 / 11번째 특성을 가지고 있다는 뜻이에요.

flag 의 각 자리수는 어떤 특성을 가리키나요?

다음 표에는 각 자리수가 의미하는 바를 정리해보았어요.
이는 SAM format specification 문서에 있는 표를 참고했습니다. (SAM format specification 문서 링크)

bit 2진수 16진수 의미
1 000000000001 0x1 template having multiple segments in sequencing
2 000000000010 0x2 each segment properly aligned according to the aligner
4 000000000100 0x4 segment unmapped
8 000000001000 0x8 next segment in the template unmapped
16 000000010000 0x10 SEQ being reverse complemented
32 000000100000 0x20 SEQ of the next segment in the template being reverse complemented
64 000001000000 0x40 the first segment in the template
128 000010000000 0x80 the last segment in the template
256 000100000000 0x100 secondary alignment
512 001000000000 0x200 not passing filters, such as platform/vendor quality controls
1024 010000000000 0x400 PCR or optical duplicate
2048 100000000000 0x800 supplementary alignment

그러면 1032 라는 flag 는 무엇을 뜻할까요?
아까 말씀드렸듯, 이 read alignment 는 12가지 특성 중 3번째 / 4번째 / 11번째 특성을 가지고 있다는 뜻이므로

  1. segment unmapped: 이 read 는 alignment 가 되지 않은 read 라는 뜻입니다.
  2. next segment in the template unmapped: 이 read 는 paired-end 인데, pair 를 이루는 다른 한쪽의 read 도 alignment 가 되지 않았다는 뜻입니다.
  3. PCR or optical duplicate: 이 read 는 PCR 과정에서 만들어진 중복 read 라는 뜻입니다.

따라서, flag 가 1032 라는 것은 이 read 가 1) unmapped 이고 2) pair 역시 unmapped 이며 3) duplicate read 라는것을 뜻해요.
이렇게 flag 로 read 의 특성을 알 수 있답니다.

samtools 의 flagstat 보는 방법

이전 포스트에서 설명드렸듯, samtools 의 여러 기능 중 하나는 flagstat 이라는 명령어로 특정 read 들의 요약된 정보를 보는거에요.
(이전 samtools 명령어에 대한 링크 참조)
다음 예시를 보세요.

$ samtools flagstat example.bam
4579959 + 0 in total (QC-passed reads + QC-failed reads)
0 + 0 secondary
0 + 0 supplementary
371078 + 0 duplicates
4532991 + 0 mapped (98.97% : N/A)
4569463 + 0 paired in sequencing
2284756 + 0 read1
2284707 + 0 read2
4413160 + 0 properly paired (96.58% : N/A)
4475527 + 0 with itself and mate mapped
46968 + 0 singletons (1.03% : N/A)
21515 + 0 with mate mapped to a different chr
15292 + 0 with mate mapped to a different chr (mapQ>=5)

예시로 만든 bam 파일의 flagstat 결과에요.
여기 나온 특성들은 위의 flag 에 설명드린 특성이랑 맞는것도 있는것 같고, 아닌것도 있는 것 같죠?
samtools 문서를 보면 아래처럼 나와있습니다. 링크

결과 이름 설명
secondary 0x100 bit set
supplementary 0x800 bit set
duplicates 0x400 bit set
mapped 0x4 bit not set
paired in sequencing 0x1 bit set
read1 both 0x1 and 0x40 bits set
read2 both 0x1 and 0x80 bits set
properly paired both 0x1 and 0x2 bits set and 0x4 bit not set
with itself and mate mapped 0x1 bit set and neither 0x4 nor 0x8 bits set
singletons both 0x1 and 0x8 bits set and bit 0x4 not set
with mate mapped to a different chr 0x1 bit set and neither 0x4 nor 0x8 bits set and MRNM not equal to RNAME
with mate mapped to a different chr (mapQ>=5) 0x1 bit set and neither 0x4 nor 0x8 bits set and MRNM not equal to RNAME and MAPQ >= 5

왜인지 몰라도 16진수로 써놨어요.
밑에는 16진수 표기가 아닌 bit 와 2진수에 따라서 좀 더 보기 편하게 표를 정리해봤어요.

결과 이름 bit 2진수 설명
secondary 256 000100000000 secondary alignment
supplementary 2048 100000000000 supplementary alignment
duplicates 1024 010000000000 PCR or optical duplicate
mapped 4 000000000100 NOT segment unmapped
paired in sequencing 1 000000000001 template having multiple segments in sequencing
read1 1 AND 64 000000000001
000001000000		 - template having multiple segments in sequencing
- the first segment in the template
read2 1 AND 128 000000000001
000010000000		 - template having multiple segments in sequencing
- the last segment in the template
properly paired 1 AND 2 AND NOT 4 000000000001
000000000010
000000000100		 - template having multiple segments in sequencing
- each segment properly aligned according to the aligner
- NOT segment unmapped
with itself and mate mapped 1 AND NOT 4 AND NOT 8 000000000001
000000000100
000000001000		 - template having multiple segments in sequencing
- NOT segment unmapped
- NOT next segment in the template unmapped
singletons 1 AND 8 AND NOT 4 000000000001
000000001000
000000000100		 - template having multiple segments in sequencing
- next segment in the template unmapped
- NOT segment unmapped
with mate mapped to a different chr 1 AND NOT 4 AND NOT 8
AND MRNM not equal to RNAME		 000000000001
000000000100
000000001000		 - template having multiple segments in sequencing
- NOT segment unmapped
- NOT next segment in the template unmapped
- mate reference name != references sequence name
with mate mapped to a different chr (mapQ>=5) 1 AND NOT 4 AND NOT 8
AND MRNM not equal to RNAME
AND MAPQ >= 5		 000000000001
000000000100
000000001000		 - template having multiple segments in sequencing
- NOT segment unmapped
- NOT next segment in the template unmapped
- mate reference name != references sequence name
- mapping quality >= 5

저도 각 결과값이 뭔지 세세히는 알지 못했는데, 이렇게 정리하고 나니 어떤 flag 를 사용해 만들어진 결과인지 알 수 있었습니다.

오늘은 bam/sam 에 있는 flag 에 대한 설명과, flagstat 결과가 ‘실제로’ 무엇을 의미하는지 살펴봤습니다.
표로 정리해봤는데 더 복잡해 보이기도 하네요 ^^;
그러나 그냥 결과를 보고 ‘그런가보다’ 하는것보다, 실제로 어떤 걸 가리키는 값인지 이해하면 더 좋겠죠?

그럼 다음에 만나요!